Wistar大鼠

利用CRISPR/Cas9技术建立C1ql3敲除大鼠。靶向C1ql3第一外显子设计两个sgRNAs，序列分别为TCATCCTCATCCCGGTGCTGG和AAGGTGCTGACAAGAGGGAGG。Cas9 蛋白 (30 ng/μL) 和两个sgRNAs (10 ng/μL)显微注射进入受精卵的胞浆，移植进入假孕母鼠。出生的小仔进行基因型鉴定。

首先，Expression Atlas(https://asia.ensembl.org)中收集的数据显示C1ql3在人、F344大鼠和C57BL/6小鼠的脑组织中高表达（图1A）。qRT-PCR结果显示，C1ql3也主要在Wistar大鼠的脑组织中表达（图1B）。其次，在原代培养中，小胶质细胞和神经元都表达C1ql3及其受体基因Bai3（图1C、D）。第三，我们检测了一些阿尔茨海默病患者大脑样本中C1ql3的表达，结果显示，与正常大脑样本相比，AD患者大脑样本中的C1ql3mRNA水平显著降低（图1E）。这些结果表明，C1ql3主要在大脑中表达且由神经元和小胶质细胞产生，其表达降低可能参与AD发展进程。

通过CRISPR/cas9策略产生C1ql3 敲除 Wistar大鼠，从14个子代中获得7个杂合敲除首建鼠（3、5、7、9、10、11、13）（图1F、G）。选择杂合的首建鼠9号和13号进行繁殖，首建鼠13号可以成功传代并产生纯合的KO大鼠。该首建鼠基因组缺失631bp的片段并导致开放阅读框的+61bp处产生终止密码子，因此导致敲除大鼠脑组织中C1ql3蛋白的表达缺陷（图1H）。与WT大鼠相比，KO大鼠的喂养、外观和体重没有明显变化（图1I）。对C1ql3 KO大鼠从出生到12个月大的存活率进行监测，结果显示C1ql3 KO不影响大鼠的寿命。这些结果表明，C1ql3敲除大鼠成功获得，并且C1ql3敲除不影响生长、发育和存活。

图1 敲除大鼠的建立和鉴定

MRI评估WT和KO大鼠脑结构变化以及海马体积改变。然后牺牲大鼠，获得整个大脑并称重。如图2结果显示，KO大鼠的海马体积和脑重量与WT大鼠没有显著差异。

图2 MRI检查敲除大鼠脑结构改变

Iba1阳性小胶质细胞的结果分析显示，KO脑中的小胶质细胞总数与WT脑中的没有差异（图3B）。然而，KO脑中分支小胶质细胞的数量显著增加了40%（图3D），肥大的小胶质细胞与WT脑相比显著减少了35%（图3E）。KO脑中小胶质细胞的平均大小也与WT脑相比较呈增加趋势（图3C）。这些结果表明C1ql3的缺失影响了小胶质细胞的形态，反映了C1ql3 KO诱导的小胶质细胞活化状态的改变。然而，尽管小胶质细胞的形态受到C1ql3缺失的影响，但与WT脑相比，KO脑中TNF-α、iNOS、IL-1β、IL-6、Mrc1和Arg1的表达并没有变化（图4A-F）。与WT脑相比，KO脑中只有抗炎因子IL-10的水平增加了55%（图4G）。这些结果表明，C1ql3 KO可能与小胶质细胞M2极化呈正相关，这与最近的一项研究结果一致。

为了进一步探讨炎症条件下C1ql3 KO对小胶质细胞的影响，我们将对照大鼠和KO大鼠进行LPS腹腔注射，一周后解剖大脑并行冠状切片。免疫组化结果显示，在LPS刺激条件下，KO脑中分支型小胶质细胞和肥大型小胶质细胞的数量分别显著减少74%和68%（图3D，E），而与WT脑相比，KO大脑中的阿米巴样小胶质细胞显著增加74%（图3F）。LPS刺激的KO脑中TNF-α、iNOS、IL-1β、IL-6、Mrc1和IL-10的表达与LPS刺激的WT脑没有差异（图4A-E，G），而抗炎因子Arg1的水平与WT脑相比显著增加了16%（图4F）。

LPS刺激后，WT和KO小胶质细胞均被LPS激活，表现为阿米巴类型小胶质细胞增多和炎症因子表达增加，如IL-1β（图4）。值得注意的是，LPS诱导的KO小胶质细胞的激活程度似乎比WT小胶质细胞更高，表现为与WT+LPS小胶质细胞相比，KO+LPS小神经胶质细胞中的阿米巴型和抗炎因子Arg-1表达增加（图4）。

总之，这些结果表明，C1ql3 KO在没有病理刺激的情况下具有更高的IL-10水平，显示出增加的抗炎活性，而在LPS刺激条件下促进小胶质细胞阿米巴样极化和抗炎活性增加。

图3 免疫组化染色观察敲除大鼠脑小胶质细胞形态变化

图4敲除大鼠脑小胶质细胞中炎症因子和抗炎因子的表达

高尔基染色评价皮层中的神经元复杂性和树突棘改变。Sholl分析显示，与WT神经元相比，KO神经元的分支显著减少（图5A，C）。这一结果表明C1ql3 KO损伤了神经元的复杂性。树突棘统计结果显示，KO神经元的树突棘总数显著减少（图5B，D），特别是与WT神经元相比，KO神经元上的蘑菇型树突棘和分支型树突棘显著减少（图5B，D）。KO大鼠脑中树突分支的减少和棘密度的降低表明C1ql3敲除损害了神经元的完整性。

图5 高尔基染色观察敲除大鼠脑神经元结构变化

采用开放旷场实验、Morris水迷宫和Y迷宫实验对动物进行行为学评价。开放旷场实验表明，KO大鼠过度活跃，运动总路程增加，移动速度增加，穿越区域的频率增加（图6 A-D）。在Morris水迷宫中，与WT大鼠相比，KO大鼠没有发现明显的认知缺陷（图6 E-H）。然而，在Y迷宫中，观察到KO大鼠的短时工作记忆受损，表现为与WT大鼠相比，自发交替率显著减少（图6I-K）。结果表明，C1ql3 敲除影响大鼠的自主运动并损伤短时工作记忆。  

图6行为学检测C1ql3 敲除大鼠的运动和认知改变

1 动物模型基因型鉴定

C1ql3敲除大鼠的基因型检测引物包括两个上游引物： 5’- TCCAAAAGCAGACAAGAGGATC -3’和5’- CTACTTCTTCACCTACCACGTCCTG-3’以及一个下游引物 5’-GGCTTCTGAAACCTTATACATTCTCG-3’.

2 WB评价该基因在敲除大鼠的蛋白表达水平

提取仔代大鼠大脑组织总蛋白，进行免疫印迹，确认C1ql3在脑组织蛋白中表达缺失。

3 生存率情况

对C1ql3 KO大鼠从出生到12个月大的存活率进行监测，结果显示C1ql3 KO不影响大鼠的寿命。

4大脑形态解剖观察

MRI和解剖观察均显示，KO大鼠的海马体积和脑重量与WT大鼠没有显著差异。

5 行为学测试

开放旷场实验中，KO大鼠表现为自主活动增加。Y迷宫中，观察到KO大鼠自发交替率显著减少。C1ql3 敲除影响大鼠的自主运动并损伤短时工作记忆。