病毒毒株 DENV NGC小鼠传代株N10。

实验动物 SPF级，4-6周，小鼠购自赛业生物技术有限公司和北京华阜康生物科技股份有限公司。于中国医学科学院医学实验动物研究所动物生物安全二级实验室（ABSL-2）中进行实验。实验动物的使用严格遵循3R原则，本实验得到了中国医学科学院医学实验动物研究所动物使用和管理委员会的批准（批准号为WW22001）。

模型建立 取100 μL病毒液（8×10⁶ Copies/μL），尾静脉接种4-6周Ifnar1-/-小鼠。每日称重，观察。采取感染后第2、4、6、8天小鼠全血，并分离血清，检测血常规、病毒载量、细胞因子；分批安乐小鼠，采取肠、脾脏、肾脏、肝脏、脑等器官，用于病毒载量检测及组织病理学观察。

DENV N10尾静脉感染小鼠临床症状观察 
通过监测小鼠体重变化、疾病表现、致死情况等，并进行临床指标评分，发现N10株对小鼠的致病性高于NGC株。为确定NGC株与N10株对小鼠复制性的差别，通过测定小鼠体内病毒载量和细胞内病毒载量，结果显示N10感染能力高于NGC。

DENV N10尾静脉感染小鼠肝损伤分析（生化检测、血管渗透、组织病理分析、细胞因子水平分析）
为分析N10 对 Ifnar1-/-小鼠脏器的损害，大体解剖和HE染色发现，与正常对照小鼠相比，DENV 感染小鼠肝损伤最为明显。血液生化指标中的肝功全项用于衡量肝脏疾病的严重程度。生化检测结果显示，相较于 NGC 组，N10 组小鼠肝损害程度更为严重。临床观察到重症登革患者具有细胞因子水平的改变。为比较 NGC 株与 N10株 DENV 对小鼠细胞因子表达的影响，收集 DENV 感染后的小鼠肝组织匀浆，通过Luminex检测多种细胞因子。结果表明：N10组中IL-6、IFN-γ、IL-13、IL-22等细胞因子水平升高，可能介导间接免疫导致的肝损伤产。为确定NGC株与N10株在小鼠体内复制水平的差异，在小鼠分别感染两株DENV 后第 2、4、6 天收集组织（肠、脾脏、肝脏、肾、脑）和血清样本，使用实时荧光定量 PCR 方法进行病毒载量的检测。伊文思蓝染色(Evans blue dye) 检测肝脏出血程度：将2%伊文思蓝液注入腹腔，3h后用冰PBS液经心脏灌注小鼠，后取出整个肝脏研磨，超声处理后离心。每个样本取0.5 mL加入等体积的50%三氯乙酸，在4℃下孵育过夜，离心。最后使用分光光度计在610 nm处测量伊文思蓝染色值并定量，结果显示N10感染组小鼠伊文斯蓝渗漏更为明显，综上结果表明：N10 株感染导致小鼠产生肝损伤。

DENV N10尾静脉感染小鼠后的肝脏组学分析
使用 NGC与N10感染小鼠后，分别抽核提取小鼠肝细胞的总 RNA，经质检后，高通量测序构建 mRNA 文库。为获得引起不同程度肝损伤的小鼠 mRNA 表达差异基因，在统计分析中，设置参数 padj 小于 0.05，log2FoldChange 大于 1，在肝细胞内，NGC 与 N10 组相比较得到32个表达上调，21 个表达下调。根据差异基因绘制聚类分析图，表明基因在不同样本中得表达趋势。上调差异基因主要有 Lipc，Cp，Xist等。下调差异基因主要有 C6，Upp2, Keg1等。提示 N10 引起小鼠严重肝损害是由于登革病毒与宿主免疫系统相互作用，使得基因发生表达差异，从而影响细胞信号通路，导致肝损伤。