小鼠的TSPO基因定位在第15条染色体上，由四个外显子（Exon）组成，外显子Exon 2和Exon 3距离较近，用于设计Floxed载体。将筛选序列（Neo）插在Exon 3和Exon 4之间，Neo基因两端使用Flp-Frt系统，在获得杂合子小鼠后可以与Flp转基因小鼠进行交配，切除Neo筛选基因。两个Loxp位点分别位于Exon 2上游及Frt下游，切除掉Frt-Neo片段后，Loxp将位于Exon 3下游，得到最终的Floxed同源染色体。

 

PCR产物为Target Region，长2.0kbp；Left Arm，长3.7kbp，Right Arm，长3.1kbp（图1）。

图1 TSPO KO载体目的条带的扩增产物鉴定

pNEB-ΔH3-LoxP4-Target Region Vector大小为6961bp，正确连接产物进行AscI和HindIII双酶切消化后得到575bp和6386bp两条产物，与预计大小相符；pNEB-ΔH3-LoxP4-Target Region-Left Arm Vector大小为10546bp，正确连接产物进行NdeI酶切消化后得到3579bp和6967bp两条产物，与预计大小相符；pNEB-ΔH3-LoxP4-Target Region-Left Arm-Right Arm Vector大小为13538bp，连接产分别物进行AscI和KpnI分别酶切验证，正确连接产物，进行AscI酶切消化后得到13538bp单一条带产物，进行KpnI酶切消化后得到1206bp、3557bp、4003bp和4772bp四条产物，与预计大小相符；pNEB-ΔH3-LoxP4-TSPO cKO Vector大小为16326bp，正确连接产物进行AscI单酶切消化后得到2000bp和13538bp两条产物，与预计大小相符（图2）。综上所述，pNEB-ΔH3-LoxP4-TSPO cKO Vector构建成功。

图2 各个片段载体构建的酶切鉴定

克隆线性化和显微注射（及ES细胞的囊胚注射）由南京大学模式动物研究所完成。完成TSPO KO Vector的线性化和显微注射后，经过Neo基因和TK基因的筛选，从南京大学模式动物研究所共获得96个ES细胞克隆，提取基因组DNA为模板，设计引物对各个片段进行PCR验证。结果，从96个克隆中首先筛选出7个能扩增出Left Arm的阳性克隆，分别是A6，B7，B12，C3，C10，E9和G5，选择A2克隆作为阴性对照（图3）。优化PCR筛选方法，依次鉴定Left Arm 3.8kb，Right Arm 3.5kb，Target Region1 4.1kb，Target Region2 4.3kb，5’-Outside Region 534bp和3’-Outside Region 560bp（图4），其中5’-Outside Region和3’-Outside Region为阴性筛选标记（即：如果载体同源重组是错误的插入了同源序列外侧的片段，则能扩增出相应片段）。最终筛选出四个克隆为正确重组的阳性克隆，分别为B7，B12，C10，G5。与南京大学模式动物研究所筛选结果整合后，选择C10克隆，扩增后进行囊胚注射。

图3  TSPO KO ES细胞克隆筛选

图4  TSPO KO ES细胞克隆各个片段的筛选

囊胚注射后选择嵌合率大于50%的嵌合体小鼠（灰色）进行交配，获得34只F1后代，基因重组杂合子小鼠2只。

从南京模式动物研究所获得的杂合子小鼠，最后要获得能够稳定遗传的TSPO基因敲除的Floxed小鼠，需要先与flp转基因小鼠交配一代，得到切除Neo基因的杂合子小鼠；随后与野生型（WT）C57小鼠进行交配繁育，通过特别设计的基因型鉴定引物，经过PCR鉴定成功后，再根据不同的研究目的，与相应的特异性启动子Cre转基因小鼠进行交配，方能得到cKO小鼠。文献报道，TSPO全身敲除（KO）后，小鼠易胚胎期死亡，不能获得出生后TSPO KO小鼠或成年KO小鼠用于后续功能学实验。因此，为了验证TSPO KO小鼠是否不能出生，我们将TSPO KO小鼠与精子特异性表达的(Protamin)Cre转基因小鼠【(Protamine)Cre⁺】进行交配，经过三代的繁育，得到TSPO^+/-小鼠（Het）并用于鉴定和后续生殖研究。

将TSPO ^Floxed/+小鼠、TSPO ^{Floxed/Floxed}小鼠和精子特异性敲除后产生的子一代TSPO ^+/-进行基因型鉴定（图5），经过显示，能够看到的WT小鼠只能扩增出250bp的条带，TSPO^Floxed/+小鼠有436bp和250bp两个条带，TSPO ^{Floxed/Floxed}小鼠只有436bp一个条带，而全身敲除的杂合子小鼠（TSPO ^+/-）有380bp和250bp两个条带。由此确定，TSPO-Floxed小鼠构建成功。

图 5  TSPO小鼠PCR鉴定

我们将TSPO-Floxed小鼠与能够在腹腔巨噬细胞中特异性表达的(LysM)Cre⁺转基因小鼠进行交配，得到的纯合子后代TSPO Floxed/Floxed, (LysM)Cre⁺小鼠能够特异性在腹腔巨噬细胞等吞噬细胞系中条件性敲除TSPO（图 6），用于对TSPO在炎症小体活化及炎症小体相关凋亡通路中的作用研究。

图 6 TSPO ^{Floxed/Floxed},(LysM)Cre⁺小鼠腹腔细胞Western blot鉴定

经过两代繁育，我们得到一只TSPO ^{Floxed/Floxed}, (LysM)Cre⁺（TSPO cKO）小鼠及其同窝对照WT小鼠，分离两只小鼠腹腔巨噬细胞，检测TSPO cKO小鼠和WT小鼠腹腔巨噬细胞对LPS和炎症小体活化剂刺激的应答（图7-8）。腹腔巨噬细胞在1μg/ml LPS孵育3h后，IL-6和TNF-α分泌明显增加，与WT细胞相比，TSPO cKO细胞分泌的IL-6和TNF-α分泌没有显著性差异。更换培养基后，加入3.5μM和7.5μM的Nigericin刺激30min，TNF-α分泌有所增加，而Nigericin不能刺激IL-6分泌。LPS刺激后IL-1β的分泌没有变化，Nigericin可以明显的激活腹腔巨噬细胞IL-1β的生成，并且TSPO cKO细胞IL-1β的分泌量显著高于WT细胞。LPS刺激及联合Nigericin刺激均未检测到IFN-α和IL-18的变化。该结果提示TSPO可能在炎症激活通路中起到负调控作用。

图7  TSPO ^{Floxed/Floxed},(LysM)Cre⁺小鼠腹腔巨噬细胞的活化（一）

A, C, E. 1μg/ml LPS孵育3h；B, D, F.更换上清后，Nigericin刺激30min。结果使用Mean±S.E.M.表示，t检验，*p<0.05，**p<0.01, ***p<0.001。

图8  TSPO ^{Floxed/Floxed},(LysM)Cre⁺小鼠腹腔巨噬细胞的活化（二）

A, C. 1μg/ml LPS孵育3h；B, D.更换培养基上清，Nigericin刺激30min。结果使用Mean±S.E.M.表示，t检验，*p<0.05，**p<0.01, ***p<0.001。

1.动物模型基因型鉴定

TSPO cKO小鼠鉴定引物

2. WB评价该基因在敲除小鼠的蛋白表达水平

    提取小鼠腹腔巨噬细胞进行免疫印迹，确认TSPO在腹腔巨噬细胞中条件性表达缺失（图6）。

3. 小鼠腹腔巨噬细胞炎症小体的活化测试

经过两代繁育，我们得到一只TSPO ^{Floxed/Floxed}, (LysM)Cre⁺（TSPO cKO）小鼠及其同窝对照WT小鼠，分离两只小鼠腹腔巨噬细胞，检测TSPO cKO小鼠和WT小鼠腹腔巨噬细胞对LPS和炎症小体活化剂刺激的应答（图7-8）。腹腔巨噬细胞在1μg/ml LPS孵育3h后，IL-6和TNF-α分泌明显增加，与WT细胞相比，TSPO cKO细胞分泌的IL-6和TNF-α分泌没有显著性差异。更换培养基后，加入3.5μM和7.5μM的Nigericin刺激30min，TNF-α分泌有所增加，而Nigericin不能刺激IL-6分泌。LPS刺激后IL-1β的分泌没有变化，Nigericin可以明显的激活腹腔巨噬细胞IL-1β的生成，并且TSPO cKO细胞IL-1β的分泌量显著高于WT细胞。LPS刺激及联合Nigericin刺激均未检测到IFN-α和IL-18的变化。该结果提示TSPO可能在炎症激活通路中起到负调控作用。